Od 1925. godine, uz veliku čitaonicu i ostale prostore, osposobljava se na drugom katu, u dvjema sobama palače Bernardi, Muzejsko-historijsko odjeljenje koje će prerasti u samostalnu ustanovu. Muzej grada osnovan je 1946. godine, a samo ime dobio je dvije godine poslije. Prvi ravnatelj bio je Marko Uvodić, autor brojnih pripovijedaka i kroničar splitskog života. Naslijedio ga je Ćiro Čičin-Šain, novinar i književnik koji je posebnu pažnju posvećivao arhivskoj građi i koji je 1950. godine pokrenuo prva muzejska izdanja.
Presudan je događaj u povijesti Muzeja velika kulturno-povijesna izložba priređena 1950. godine inicijativom JAZU-a i Ministarstva kulture, prigodom proslave 500. obljetnice rođenja Marka Marulića. Izložba je bila postavljena u prizemlju i na prvom katu Papalićeve palače da bi se po njezinu završetku taj prostor trajno ustupio Muzeju. Muzej je svečano otvoren javnosti 1952. godine s djelomičnim postavom koji je obuhvatio povijest splitske autonomne komune i mletačke vladavine, a u prizemlju je bilo izloženo oružje koje se koristilo u obrani grada. Od 1960. do 1979. godine ravnatelj Muzeja bio je Duško Kečkemet, poznavatelj splitske povijesti i umjetnosti te pokretač vrijednih edicija i stručnih publikacija.
Od 1984. godine počinje generalna sanacija i proširenje muzejskog sklopa, koja završava 1992. godine kada se prvi put u svojoj povijesti Muzej otvara javnosti cjelovitim stalnim postavom. Prvi put od nastanka Muzeja 1915. godine bilo je moguće izložiti fundus koji prezentira kulturno-povijesnu baštinu grada.
U sklopu Muzeja nalazi se Galerija Emanuel Vidović, posvećena najznačajnijem splitskom slikaru 20. stoljeća i jednom od najistaknutijih protagonista hrvatskog modernog slikarstva.